1 エライザ法(サンドイッチ酵素抗体法(牛海綿状脳症診断用酵素抗体反応キットを使用して行うものに限る。)による方法)による検査の場合 1緩衝液で所定の倍数に希釈した延髄の閂部を含む脳乳剤とプロテイナーゼKを混合し、十分間三十七度の温度で保温した後、濃縮し、5分間百度の温度で処理すること。 2 抗プリオン蛋白質抗体を固相化した検査用プレート(以下「TSE診断プレート」という。)に1により調整した被検検体を緩衝液で所定の倍数に希釈し、当該検体を分注した後、密封し、75分間三十七度の温度で感作した上、洗浄液で洗浄すること。 3 2により処理したTSE診断プレートに酵素標識抗体液(使用する直前に調整したもの)を分注した後、密封し、1時間四度の温度で感作すること。 4 3により感作したTSE診断プレートを洗浄液で洗浄し、これに基質溶液(使用する直前に調整したもの)を分注した後、遮光して30分間室温で感作し、反応停止液を分注し、所定の波長で測定した吸光度値により判定すること。 5 吸光度値が陰性対照の平均吸光度値に所定の値を加えた値(以下この項、第3項及び第4項において「カットオフ値」という。)の90パーセント以上であるものを再検査することとし、カットオフ値の90パーセント未満であるものを陰性とすること。 6 5により再検査することとなった検体のサンプルについてTSE診断プレートの二穴を利用して再検査を実施し、二穴のうちいずれかの吸光度値がカットオフ値の90パーセント以上であるものを陽性とし、二穴ともカットオフ値の90パーセント未満であるものを陰性とすること。 2 エライザ法(サンドイッチ酵素抗体法(アビジン―ビオチンカップリング法)による方法)による検査の場合 1プレートにプロテイナーゼKが分注された緩衝液で所定の倍数に希釈した延髄の閂部を含む脳乳剤を分注した後、密封し、12分間から16分間までの間十七度から二十七度までの温度で振とうした後、28分間から32分間までの間四十度から四十四度までの温度で振とうし、当該プレートに消化停止薬を分注すること。 2 1により調整した被検検体を密封し、28分間から32分間までの間十七度から二十七度までの温度で振とうした後、ストレプトアビジンを固相化した検査用プレート(以下「ストレプトアビジン固相プレート」という。)に当該検体を分注すること。 3 2により処理したストレプトアビジン固相プレートに検出用溶液を分注した後、密封し、55分間から65分間までの間十七度から二十七度までの温度で振とうすること。 4 3により処理したストレプトアビジン固相プレートを洗浄液で洗浄し、これに基質溶液を分注した後、密封し、8分間から12分間までの間十七度から二十七度までの温度で振とうし、反応停止液を分注し、所定の波長で測定した吸光度値により判定すること。 5 吸光度値が、陰性対照の中央値に所定の値を乗じて得た値に所定の値を加えた値(以下この項において「カットオフ値」という。)以上であるものを再検査することとし、カットオフ値未満であるものを陰性とすること。 6 5により再検査することとなった検体のサンプルについてストレプトアビジン固相プレートの二穴を利用して再検査を実施し、二穴のうちいずれかの吸光度値がカットオフ値以上であるものを陽性とし、二穴ともカットオフ値未満であるものを陰性とすること。 3 エライザ法(サンドイッチ酵素抗体法(ワンステップ測定法)による方法)による検査の場合 1緩衝液で所定の倍数に希釈した延髄の閂部を含む脳乳剤をデオキシリボヌクレアーゼⅠ及びコラゲナーゼで処理し、プロテイナーゼKと混合し、30分間三十七度の温度で保温した後、濃縮し、5分間百度の温度で処理すること。 2 TSE診断プレートに1により調整した被検検体を緩衝液で所定の倍数に希釈し、当該検体を分注すること。 3 2により処理したTSE診断プレートに酵素標識抗体液を分注した後、密封し、1時間三十七度の温度で感作すること。 4 3により感作したTSE診断プレートを洗浄液で洗浄し、これに基質溶液を分注した後、遮光して30分間室温で感作し、反応停止液を分注し、所定の波長で測定した吸光度値により判定すること。 5 カットオフ値の90パーセント以上であるものを再検査することとし、カットオフ値の90パーセント未満であるものを陰性とすること。 6 5により再検査することとなった検体のサンプルについてTSE診断プレートの二穴を利用して再検査を実施し、二穴のうちいずれかの吸光度値がカットオフ値以上であるものを陽性とし、二穴ともカットオフ値未満であるものを陰性とすること。 4 エライザ法(サンドイッチ酵素抗体法(ワンポット前処理法)による方法)による検査の場合 1破砕した延髄の閂部、プロテイナーゼK及びマイクロバイアルセリンプロテイナーゼを混合し、均1となるように撹拌した後、十分間五十六度の温度で感作し、十分間百度の温度で処理してから三十七度の温度以下に冷却すること。 2 TSE診断プレートに、1により調整した被検検体を分注した後、密封し、1時間三十七度の温度で感作した上、洗浄液で洗浄すること。 3 2により処理したTSE診断プレートに標識抗体液を分注した後、密封し、30分間四度から八度までの温度で感作すること。 4 3により感作したTSE診断プレートを洗浄液で洗浄し、これに基質溶液を分注した後、遮光して30分間室温で感作し、反応停止液を分注し、所定の波長で測定した吸光度値により判定すること。 5 カットオフ値の90パーセント以上であるものを再検査することとし、カットオフ値の90パーセント未満であるものを陰性とすること。 6 5により再検査することとなった検体のサンプルについてTSE診断プレートの二穴を利用して再検査を実施し、二穴のうちいずれかの吸光度値がカットオフ値以上のものを陽性とし、二穴ともカットオフ値未満のものを陰性とすること。 5 ウエスタンブロット法による検査の場合 1緩衝液で所定の倍数に希釈した延髄の閂部を含む脳乳剤とプロテイナーゼKを混合し、30分間三十七度の温度で保温した後、濃縮し、5分間百度の温度で処理すること。 2 1により調整した被検検体及び指示検体をゲルに注入し、30分間二百ボルトで電気泳動した後、当該ゲルからブロッティング膜へ蛋白質の転写を行うこと。 3 2により調整したブロッティング膜に抗プリオン蛋白質抗体を加え、1時間室温で感作し、洗浄液で洗浄した後、標識抗体を加え、45分間室温で感作すること。 4 3により調整したブロッティング膜を洗浄液で洗浄し、化学発光試薬と反応させ、異常プリオン蛋白質の存在を確認すること。 6 免疫組織化学的検査の場合 1閂部を含む延髄を中性緩衝ホルマリンで固定し、三叉神経脊髄路核、孤束核及び迷走神経背側核が含まれる部分を切り出し、ギ酸で不活化処理した後、パラフィン包埋及び薄切を行い標本を作製すること。 2 1により作製した標本をギ酸及びオートクレーブにより処理し、抗プリオン蛋白質抗体を加え、60分間室温で感作すること。 3 2により調整した標本を緩衝液で洗浄した後、標識抗体及び酵素標識試薬を加え、20分間室温で感作し、基質を加え、発色させること。 4 3により調整した標本を光学顕微鏡で観察し、異常プリオン蛋白質の存在を確認すること。 |